Хотя тогда я не
отдавал себе в этом отчета, но задумав
использовать два олигонуклеотида, расположенных
по обе стороны от исследуемого гена, с 3'-концами,
направленными друг к другу, я был очень близок к
открытию ПЦР. В тот момент, однако, я был и на
грани падения с горной дороги и остро ощущал это.
Влажный ночной воздух был наполнен
ароматом цветущих каштанов. Их белые "свечи"
как бы выскакивали на меня в свете фар. Я думал о
новых прудах, которые делал у себя на участке, а
также о возможных осложнениях в планируемом
опыте по секвенированию.
Еще с тех пор, когда я
стажировался в лаборатории В. Сэди в
Калифорнийском университете в Сан-Франциско, где
Дж. Мейбаум разрабатывал для клиники метод
определения нуклеотидов, я помнил, что препараты
ДНК могут содержать следовые примеси
нуклеозидтрифосфатов. Если эти случайные
нуклеотиды будут присоединяться к 3'-концам
праймеров до того, как произойдет присоединение
меченых ddNTP, интерпретировать результаты
электрофореза окажется непросто.
Сначала я считал, что свободные
нуклеозидтрифосфаты в пробе можно разрушить с
помощью щелочной фосфатазы - бактериального
фермента. Этот фермент отщепит от
нуклеозидтрифосфатов необходимые для реакции
остатки фосфата, предотвратив их участие в
реакции полимеризации. Однако после этого
придется каким то способом удалить фосфатазу из
реакционной смеси, иначе она разрушит ddNTP,
которые я добавлю. Обычно ферменты, активность
которых нежелательна, можно инактивировать
нагреванием пробы; при этом нарушается форма
молекул фермента, важная для его
функционирования действия. Однако я был уверен,
что молекулы бактериальной щелочной фосфатазы
после нагревания способны восстанавливать
исходную форму и поэтому решил ее не
использовать.
Однако я ошибался. Значительно
позже я узнал, что щелочную фосфатазу можно
необратимо денатурировать, если полностью
удалить из раствора ионы цинка и прогреть пробу.
Как выяснилось, моя ошибка оказалась на редкость
удачной: если бы я был лучше осведомлен, я
перестал бы искать новые варианты эксперимента.
Примерно каждую милю у меня
рождалось новое решение, которое я тут же
отбрасывал. Потом, когда начался спуск в долину
Андерсона, пришла мысль применить один и тот же
фермент - ДНК-полимеразу - дважды, сначала для
того, чтобы удалить из пробы находящиеся в ней
нуклеозидтрифосфаты, а затем, чтобы присоединить
к праймеру меченые ddNTP.
Я рассуждал так. Если в пробе
присутствует достаточно нуклеотидов, чтобы
исказить мой эксперимент, их должно быть также
достаточно для функционирования ДНК-полимеразы.
Если сначала провести своего рода имитацию
реакции в присутствии олигонуклеотидных
праймеров и ДНК-полимеразы, но без ddNTP, то можно
без труда удалить свободные
нуклеозидтрифосфаты, которые присоединятся к
удлиняющимся олигонуклеотидам. Затем, повысив
температуру реакционной смеси, я смогу отделить
удлиненные олигонуклеотиды от матрицы ДНК.
Однако при этом олигонуклеотиды с наращенными
концами останутся в пробе, но таких праймеров
будет намного меньше, чем исходных неудлиненных,
поэтому, когда температура смеси снизится, с ДНК,
вероятно, будут связываться преимущественно
неудлиненные праймеры. Затем можно добавить ddNTP и
новую порцию ДНК-полимеразы уже для проведения
самого эксперимента по секвенированию.
И все-таки некоторые вопросы
продолжали беспокоить меня. Будут ли мешать
реакции олигонуклеотиды, синтезированные в
имитационной реакции? Что если они удлинятся не
на один-два, а на большее число нуклеотидов и
перекроют участок связывания второго праймера?
Конечно, это приведет к осложнениям...
Нет, отнюдь! Я вздрогнул от
неожиданного прозрения: цепи ДНК в исходной
матрице и в удлиненном олигонуклеотиде по
последовательности нуклеотидов будут идентичны.
В итоге в реакции имитации число ДНК-матриц для
секвенирования удвоится! Неожиданно для меня
аромат цветущих каштанов стал резко ослабевать.
ЕСЛИ бы это было при обычных
обстоятельствах, я бы не понял значения удвоения
так быстро. Действительно, идея о многократном
повторении одной и той же процедуры может
показаться совсем скучной, однако я тратил массу
времени на составление компьютерных программ и
познакомился при этом с циклически
повторяющимися "петлями" - процедурами, при
которых одна и та же математическая операция
многократно используется для преобразования
результатов предыдущих циклов. Мой опыт
подсказывал мне, что процессы экспоненциального
роста в циклически повторяющихся операциях
могут быть очень значительными. А вариант
репликации ДНК, о котором я размышлял,
представлял собой как раз такой процесс.
Взволнованный, я стал
перебирать в памяти степени числа 2: 2, 4, 8, 16, 32...
Я помнил, что 2 в десятой степени
составляет приблизительно 1000, а 2 в двадцатой
степени - миллион. На выезде из долины Андерсона я
остановил машину, достал бумагу и карандаш, чтобы
проверить свои расчеты. Дженнифер, моя спящая
пассажирка, слабо протестовала против задержки и
против света в кабине, но я воскликнул, что открыл
нечто фантастическое. В замешательстве она
заснула снова. Я убедился в том, что 2 в двадцатой
степени составляет несколько больше миллиона, и
поехал дальше.
Приблизительно через милю пути
я понял еще кое-что о продуктах реакции. После
нескольких циклов, состоящих из наращивания
праймеров, отделения продуктов полимеризации,
связывания новых праймеров и их наращивания,
длина экспоненциально накапливающихся цепей ДНК
окажется фиксированной, поскольку их концы будут
точно определяться 5'-концами олигонуклеотидных
праймеров. Если синтезировать праймеры,
связывающиеся с более удаленными друг от друга
участками ДНК, можно реплицировать в исходном
препарате фрагменты ДНК большей длины.
Продуктами реакции всегда будут фрагменты ДНК
строго определенной длины.
Я вновь остановил машину и
принялся рисовать, как молекулы ДНК связываются
друг с другом и удлиняются и как продукты одного
цикла становятся матрицами для последующих
циклов в цепной реакции... Дженнифер снова
запротестовала сквозь сон. "Ты ни за что не
поверишь, - крикнул я, - это невероятно!"
Она не проснулась. Я поехал
дальше, не останавливаясь до самого дома. В конце
долины Андерсона начинаются секвойные леса.
Существует давнее поверье, что в этих местах
живут раззявы-неумехи. Я почувствовал, что своим
открытием почти нарушил это представление. В ту
ночь мне не спалось - в мозгу непрерывно
взрывались дезоксирибонуклеиновые бомбы.
Утром я был слишком изнурен и не
мог поверить, что эту идею еще никто не
реализовал. Тысячи ученых с разными целями
производили наращивание олигонуклеотидов с
использованием полимераз, и, конечно, кто-нибудь
из них должен был заметить возможность
полимеразной цепной реакции. Но если бы она
кому-то удалась, я знал бы об этом: исследователи
должны были бы использовать ее постоянно для
амплификации, или размножения фрагментов ДНК.
Вернувшись в понедельник в свою
фирму, я обратился к Дж. Макгрегору, одному из
библиотекарей, с просьбой провести компьютерный
анализ литературы по ДНК-полимеразе. Он не
обнаружил ничего, имеющего отношения к
амплификации. На протяжении следующих
нескольких недель я излагал свою идею любому
желающему выслушать меня. Никто не слышал, что
это когда-либо пробовали осуществить; никто не
мог также привести разумных доводов, позволяющих
понять, почему это невыполнимо. Тем не менее идея
ни у кого не вызывала особого энтузиазма. До
этого случая мои коллеги скептически относились
к моим идеям, касающимся ДНК, и часто, поразмыслив
несколько дней, я соглашался с ними. Однако на
этот раз я понимал, что приблизился к чему-то
значительному.
Прошли месяцы, прежде чем я
подготовился к своему первому эксперименту по
проверке принципа ПЦР. Мне пришлось основательно
поработать с литературой, чтобы правильно
использовать буферные растворы, подобрать
концентрации реагентов, решить, как долго
следует нагревать и охлаждать реакционные смеси
и т. д. Полезными оказались некоторые ранние
работы Корнберга, посвященные ДНК-полимеразе.
Для проведения опыта в качестве ДНК-матрицы я
выбрал участок плазмидной ДНК длиной 25
нуклеотидных пар и два олигонуклеотида длиной
соответственно 11 и 13 нуклеотидов.
